En pocas palabras
Un equipo encontró una forma de observar células activas en zonas profundas del cerebro de ratones sin retirar las capas que las cubren. La técnica recoge mucha más luz que los métodos anteriores usando la misma potencia del láser. Así, permite estudiar algunas regiones más profundas, aunque no todas.
El obstáculo no es solo la profundidad
En un cerebro vivo, la luz no llega fácilmente a las zonas profundas. Al atravesar el tejido se dispersa, y las señales de las células que se quieren observar se mezclan con un resplandor de fondo difícil de separar. Por eso, en algunos experimentos los científicos han tenido que retirar el tejido que cubre la zona de interés para conseguir una imagen más clara. Una nueva plataforma desarrollada por un equipo de Rockefeller University permite observar más profundamente la actividad de las neuronas de ratones sin quitar la corteza que está encima.
El avance aborda dos dificultades a la vez. Cuanto más se adentra la luz en el tejido cerebral, más se dispersa y más difícil resulta determinar de dónde viene la señal fluorescente. Pero no basta con enviar más luz para superar ese ruido: aumentar la potencia media del láser puede calentar el tejido y dañarlo. El desafío consiste, entonces, en obtener una señal útil sin superar los límites seguros de exposición.
Los microscopios de fluorescencia aprovechan moléculas que emiten luz cuando se activan. En el cerebro, esas señales permiten seguir la actividad de las células, incluidos los cambios de calcio dentro de las neuronas. Sin embargo, la luz dispersa puede crear un resplandor de fondo que oculta la señal buscada. El problema se intensifica a medida que las células están más lejos de la superficie del cerebro, lo que dificulta distinguir la actividad de cada una.
En este contexto, la microscopía de tres fotones ofrece una posible ventaja: produce menos fluorescencia de fondo que la de dos fotones, por lo que, en principio, resulta adecuada para observar a mayor profundidad. Para aprovecharla, sin embargo, hacen falta pulsos láser suficientemente intensos como para generar una señal medible. Surge así una disyuntiva entre ver más profundo y mantener el tejido a salvo. Resolverla no consistía simplemente en aumentar la energía o cambiar una sola pieza del equipo.
Un sistema de imágenes pensado de nuevo
En lugar de tratar el microscopio como un conjunto de ajustes fijos, el equipo de Alipasha Vaziri, director del Laboratorio de Neurotecnología y Biofísica de Rockefeller University, replanteó cómo coordinar sus distintos componentes. Los investigadores llamaron TrUDI a la plataforma, nombre que corresponde a la sigla en inglés de «imagen de tres fotones a gran profundidad». Los resultados se publicaron en la revista Nature Methods en un estudio sobre el registro de la actividad de grupos de neuronas con resolución celular y a una profundidad cercana a los 2 milímetros.
El equipo utilizó modelos computacionales para orientar los cambios en el láser, la óptica y el sistema de detección de señales. El objetivo no era simplemente alcanzar la mayor profundidad posible: también había que equilibrar las características de los pulsos de excitación, la forma en que la luz viaja y se recoge, y tanto la velocidad de captura como el área observada. El diseño tuvo en cuenta los límites de seguridad de la exposición al láser y la necesidad de medir los cambios de calcio con suficiente precisión para distinguir células individuales.
La clave está en que el rendimiento no depende de una sola pieza del aparato. El láser elegido debe funcionar en conjunto con el sistema óptico, y el método de escaneo y registro tiene que ajustarse al tiempo que duran las señales neuronales. Si esos elementos no se coordinan, pueden desperdiciarse fotones útiles o aumentar la luz no deseada, aunque cada componente funcione bien por separado. Por eso, el equipo optimizó el sistema completo en vez de limitarse a modificar un ajuste habitual.
Una señal más intensa sin aumentar la potencia del láser
El resultado cuantitativo más destacado del estudio es que TrUDI permitió detectar cerca de 250 veces más fotones de fluorescencia que los métodos anteriores al utilizar la misma potencia del láser. La comparación es importante porque detectar más fotones aporta más información sobre la señal, sin recurrir simplemente a elevar la potencia media del láser, algo que podría calentar el tejido o dañarlo.
Esto no significa que todas las señales, en todas las regiones, se hayan vuelto más intensas en la misma proporción, ni que ahora sea posible ver cada parte del cerebro. El resultado indica que los cambios coordinados aumentaron la cantidad de luz fluorescente que la plataforma puede recoger en sus condiciones de funcionamiento. Gracias a ello, fue posible distinguir la actividad de células individuales a una profundidad que antes resultaba difícil alcanzar. La utilidad de cada medición sigue dependiendo de la zona observada, de las propiedades ópticas del tejido y de los límites de seguridad.
Los investigadores también incorporaron un método para estimular las células seleccionadas en lugar de iluminar de forma continua todo el campo de visión. Con este método, el láser se activa cuando el escaneo pasa por las células previamente identificadas y no se utiliza de la misma manera en las demás zonas. Dirigir la excitación hacia las células de interés permite usar la luz de forma más selectiva y forma parte de un conjunto de mejoras destinadas a reforzar la señal sin perder de vista la cantidad de luz que llega al tejido.
De un límite de 1,2 milímetros a casi 2
Antes de este trabajo, los registros funcionales con microscopía de tres fotones llegaban a profundidades cercanas a 1,2 milímetros. Ese alcance era menor que la profundidad teórica que la técnica puede alcanzar, superior a 2 milímetros. Los resultados de TrUDI muestran que coordinar el láser, la óptica y el registro puede acercar las imágenes a ese rango más profundo, en vez de considerar que el rendimiento previo era un límite insuperable.
El equipo probó la plataforma en ratones y logró registrar la actividad de grupos de neuronas de la corteza cerebral y el hipocampo a una profundidad cercana a los 2 milímetros. El campo de visión abarcó unos 230 × 230 micrómetros y la frecuencia de registro llegó a 8,6 hercios. Estas cifras ayudan a entender el alcance del avance: no se trata solo de obtener una imagen fija de una estructura profunda, sino de seguir una actividad neuronal cambiante en un área concreta y a una frecuencia determinada.
Estos detalles importan para interpretar lo que el aparato puede hacer. Un campo de visión de 230 × 230 micrómetros representa una porción relativamente pequeña de tejido, mientras que una frecuencia de 8,6 hercios determina cada cuánto se capturan los datos. Por eso, no hay que imaginar que la técnica muestra todo el cerebro de una vez o registra cualquier actividad neuronal sin límites. Es una herramienta para estudiar grupos de células en zonas profundas, con restricciones espaciales y temporales que deben tenerse en cuenta al diseñar los experimentos.
¿Por qué importa conservar la corteza?
Cuando para estudiar una región profunda es necesario retirar el tejido que la cubre, cambia el contexto anatómico en el que funciona la zona de interés, y compararla con un cerebro que no ha sido intervenido puede resultar más complicado. En cambio, obtener imágenes a través de las capas que permanecen intactas permite observar algunos circuitos profundos sin retirar la corteza. Esto no elimina todos los efectos de los procedimientos experimentales, pero amplía las posibilidades de estudiar la actividad sin quitar el tejido que cubre la zona, siempre que la luz pueda llegar al objetivo.
Esta capacidad podría ayudar a comprender cómo coordinan su actividad los grupos de neuronas en regiones profundas del cerebro. En vez de limitar las observaciones a la superficie, los investigadores pueden seguir células de la corteza y el hipocampo a mayor profundidad y estudiar los cambios simultáneos en su actividad dentro del área disponible para la captura. Sigue siendo, no obstante, una mejora de las herramientas de medición: la plataforma no explica por sí sola qué función cumplen los circuitos neuronales, pero puede aportar datos para formular preguntas y experimentos más precisos.
Es importante distinguir entre alcanzar cierta profundidad y poder observar todas las estructuras que se encuentran a esa distancia. La forma y la ubicación de cada región, así como las propiedades del tejido que la rodea, influyen en la posibilidad de obtener imágenes. Vaziri señaló que algunas partes del cuerpo estriado siguen fuera del alcance de este método y que, para llegar a varios núcleos más profundos, se necesitan técnicas invasivas. Por eso, acercarse a los 2 milímetros no significa que el aparato pueda observar cualquier objetivo cerebral que elija un investigador.
Qué demuestra el estudio y qué queda por resolver
El trabajo demuestra que es posible mejorar las imágenes de zonas profundas ajustando de manera coordinada los componentes del sistema, en vez de limitarse a aumentar la potencia del láser. En TrUDI, las características de la excitación óptica se combinaron con las capacidades del sistema óptico y con el método de recopilación de datos, teniendo en cuenta la calidad de la señal y las restricciones térmicas, temporales y espaciales. Con ese enfoque, el equipo aumentó la fluorescencia detectada y registró actividad celular a una profundidad cercana a los 2 milímetros en cerebros de ratones vivos.
Los resultados no implican que la técnica ya pueda reemplazar de manera general los demás métodos de imagen cerebral ni que elimine la necesidad de intervenciones quirúrgicas en todos los experimentos. Algunos objetivos profundos siguen fuera del alcance demostrado, ciertas zonas del cuerpo estriado no son accesibles y las imágenes se obtienen en un campo de visión y a una frecuencia de registro determinados. El aporte de la plataforma consiste en ampliar el territorio que puede estudiarse con luz mientras se conserva la corteza sobre las zonas observadas, no en borrar todas las limitaciones técnicas.
Los próximos pasos dependerán de cómo se utilice esta herramienta para responder preguntas concretas sobre el sistema nervioso y de si resulta adecuada para otras regiones y tipos de experimento. Por ahora, el estudio demuestra que es posible acercarse al límite teórico de la microscopía de tres fotones mediante mejoras integradas y cuidadosamente planificadas, probadas en ratones. Las cifras actuales, por sí solas, no permiten determinar hasta dónde podrían extenderse estas posibilidades en regiones más profundas o en configuraciones diferentes.
Conclusión
El equipo del Laboratorio de Neurotecnología y Biofísica de Rockefeller University desarrolló TrUDI, una plataforma para observar la actividad de las neuronas en zonas profundas del cerebro de ratones sin retirar la corteza que las cubre. Al coordinar el láser, la óptica y el registro, detectó cerca de 250 veces más fotones de fluorescencia con la misma potencia del láser y registró actividad con resolución celular a una profundidad cercana a los 2 milímetros, frente a los aproximadamente 1,2 milímetros de los registros anteriores. Las pruebas abarcaron la corteza y el hipocampo, en un campo de 230 × 230 micrómetros y a 8,6 hercios. Es una ampliación importante de las herramientas para estudiar el cerebro, aunque no permite observar todas las regiones profundas ni evita la necesidad de métodos invasivos en algunas zonas.